|
| |
|
|
Studium vlastností membránového napěťového senzoru ASAP1 exprimovaného v buněčné linii HEK 293
Sanetrníková, Dominika ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Svoboda, Ondřej (vedoucí práce)
Tato práce se v úvodu věnuje seznámení s plasmidovou DNA, která se v podobě vektoru využívá v molekulární biologii. Ve formě fluorescenčních sond lze plasmidy využít pro měření změn membránového potenciálu. Do jejich struktury se přidává barvivo fluorofor. Důležitým zástupcem této práce je fluorescenční sonda ASAP1, která obsahuje zelený fluorescenční protein, jehož reakcí na změnu membránového potenciálu je pokles intenzity emitovaného světla. Cílem práce bylo provést chemickou transfekci tohoto plasmidu do buněčné linie HEK293 a provést jeho charakterizaci. V práci je rovněž navržena metoda pro analýzu časového průběhu změn fluorescence v závislosti na depolarizaci buněčné membrány. V závěru práce je popsán uskutečněný experiment včetně diskuze získaných výsledků.
|
|
|
Vizualizace značených buněk modelového organismu
Kubíček, Radek ; Kršek, Přemysl (oponent) ; Herout, Adam (vedoucí práce)
Tato diplomová práce, zabývající se zobrazením volumetrických (objemových) dat, má za úkol zobrazit a zvýraznit značené buňky modelových organismů v datech sejmutých konfokálním mikroskopem. Vstupní data tvoří jednolitý volumetrický celek složený z jednotlivých řezů, který je nutno vhodnou metodou zobrazit a poté identifikovat a zvýraznit buňky označené metodou GFP (Green Fluorescent Protein) nebo fluoreskováním chlorofylu. Hlavním cílem této práce je nalézt pokud možno optimální efektivní metodu umožňující toto zvýraznění, pracující ideálně bez manuálního zásahu uživatele. Vzhledem ke struktuře dat je však tento cíl jen těžko splnitelný, proto postačí nalezení metody operující v manuálním režimu. Nakonec je třeba dosažené výsledky práce zaintegrovat do nástroje FluorCam pro zobrazování dat z dekonvolučního konfokálního mikroskopu.
|
|
|
Adapting Genetic Methods For Transposon Mutagenesis And Fluorescent Markers In Borrelia
WEBER, Peter
The aim of this Bachelor thesis was the examination and generation of different mutants in various Borrelia species. While several assays were used to examine aspects of B. burgdorferi transposon mutants, genetic tools were applied in order to generate fluorescent markers in B. afzelii and a vector construct in B. burgdorferi. This work should provide an overview of various genetic methods and their methodology that have been developed in Borrelia bacteria.
|
|
|
Ontogenetický původ chrupavčitých elementů lebky axolotla
Kloučková, Lenka ; Černý, Robert (vedoucí práce) ; Roček, Zbyněk (oponent)
Ačkoliv některé aspekty jednotlivých studií se liší, je všeobecně přijímán fakt, že chrupavčité elementy viscerokrania obratlovců mají svůj původ v buňkách neurální lišty. Ve své práci upřesňuji tento fakt na modelovém živočichovi Ambystoma mexicanum na základě isotopických a isochronických transplantací prekurzorů neurální lišty - neurálních valů, případně již uzavřené neurální trubice před odmigrováním buněk. Celkem jsem pro svůj výzkum provedla 179 transplantací. Analyzovala jsem poté 67 embryí ve stadiích 40-42 a 7 larev o délce 15-19 mm. Touto moderní metodou prokazuji, že ventro-kaudální element viscerokrania nemá původ v neurální liště. Dále potvrzuji a upřesňuji, ze které anterio-posteriorní úrovně neurálních valů, případně rhombomer zadního mozku vznikají jednotlivé proudy neurální lišty a následně viscerální chrupavky axolotla. Jeden z elementů, basibranchiale 1, má dokonce dvojí původ. Uvádím a diskutuji zde také některé další deriváty hlavové neurální lišty jako například mezenchym hlavy a vnějších žaber, trabekuly, část otické kapsule nebo pojivové tkáně v hlavě.
|
|
|
Měření vnitrobuněčné koncentrace iontů v mikroorganismech
Vodáková, Adéla ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Diplomová práce se zabývá měřením vnitrobuněčné koncentrace iontů v bakteriích Escherichia coli a kvasinkách Saccharomyces cerevisiae pomocí geneticky kódovaných fluorescenčních sond obsahujících zelený fluorescenční protein (GFP). V úvodu práce shrnuji známé poznatky o tomto proteinu a jeho spektrálních charakteristikách. Pro experimentální část práce byl vybrán senzor reagující na změny pH ve svém okolí změnou poměru intenzity fluorescence dvou pásů v excitačním spektru - poměrový pHluorin. Tato sonda byla otestována jak v bakteriálních, tak v kvasinkových buňkách. Byla sledována schopnost mikrobiálních buněk udržovat si stálou hodnotu cytosolického pH při odlišných vnějších podmínkách, jako je různé pH suspenze, přidání glukózy či KCl do suspenze. V práci je dále řešen problém odstranění příspěvku autofluorescence buněk ze signálu GFP při kalibraci a následném měření vnitrobuněčného pH. Úspěšně byla použita metoda synchronně skenované fluorescence pro potlačení nechtěných příspěvků. Při použití této metody navíc dochází k vylepšení poměru signálu k šumu a tím k zpřesnění odečítaných hodnot cytosolického pH.
|
|
|
Optimalizace rekombinantní exprese proteinů v HEK293 buněčné linii
Bláha, Jan ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
Savčí buňky jsou dominantním systémem pro rekombinantní expresi farmaceutických proteinů. S rozvojem metodiky transientní transfekce savčích buněk se tento systém stává vhodným také pro strukturní biologii. Tato práce se zabývala optimalizací rekombinantní exprese v buněčných liniích HEK293T a HEK293-6E v různých médiích za použití snadno stanovitelných reportérových proteinů - sekretované alkalické fosfatasy (SEAP) a zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Důraz byl kladen na optimalizaci klíčových faktorů tvorby transfekčního komplexu - poměru DNA a polyethyleniminu a množství vložené DNA. Sledován byl i pozitivní vliv inhibitoru histonových deacetylas kyseliny valproové a dále kaseinového hydrolyzátu Tryptone N1.
|
|
|
Studium exprese jaderného receptoru nhr-97 v Caenorhabditis elegans
Boušová, Kristýna ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Jaderné hormonální receptory (NHR) patří mezi důležité transkripční faktory, které regulují vývoj a metabolismus u velké části živočichů. Caenorhabditis elegans obsahuje 284 jaderných receptorů, což je neobvykle velké množství oproti receptorům nalezeným u Drosophila melanogaster (18) a u člověka (48). Patnáct z těchoto receptorů C. elegans má homologní strukturu s receptory D. melanogaster a se savci. Zbylých 269 NHR jsou specifické pouze pro hlístice a patří do skupiny tzv. doplňkových jaderných receptorů (SupNRs), jejichž evolučním předchůdcem je HNF4 - důležitý transkripční faktor u člověka. V této práci jsme popsali jaderný hormonální receptor nhr-97, jehož exprese a funkce dosud nebyly studovány. Gen je kódován v genomu C. elegans a patří mezi SupNRs. Nhr-97 tvoří dvě isoformy A a B, jejichž exprese je v tkáních C. elegans odlišná. Lokalizace exprese genu in vivo byla určena pomocí transgenních linií exprimujících nhr-97::GFP. Pro isoformu A byla exprese nhr-97 lokalizována v neuronech v oblasti hltanu a v oblasti ocásku, ve střevě a v hypodermis, pro isoformu B v hltanu, v neuronech okolo korpusu hltanu, v hlavové mesodermální buňce a v análním svěrači. Exprese nhr-97 během vývoje C. elegans byla stanovena pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR). Zjistili jsme, že mRNA...
|
|
|
Dynamics and variability of induced transgene silencing in tobacco cell line BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Pečinka, Aleš (oponent) ; Lafon Placette, Clément (oponent)
RNA interference (RNAi) je důležitým mechanismem regulace genové exprese u rostlin. RNAi u rostlin je spouštěna přítomností dvouvláknové RNA (dsRNA), která je následně zpracována na malé RNA (sRNA) o délce 21-24 nt. Malé RNA po navázání na protein Argonaut (AGO) jsou schopné rozeznat cílovou molekulu na základě sekvenční komplementarity. Pokud je cílem mRNA, může ji AGO rozštěpit, nebo může blokovat translaci, což vede k posttranskripčnímu umlčení (PTGS). Pokud je cílem DNA, tak může navodit její metylaci, což vede k transkripčnímu umlčení (TGS), pokud dojde k metylaci v promotoru. Jednotlivé komponenty RNAi jsou celkem dobře popsány, ale méně je známo o vlivu odlišných typů dsRNA prekursorů na dynamiku RNAi. Ke studiu těchto aspektů RNAi jsme využili tabákovou buněčnou linii BY-2 s reportérovým genem pro GFP cíleným silencery s inducibilní expresí. Fungování silencerů bylo založeno na třech základních způsobech tvorby dsRNA: transkripcí antisense GFP (AS), GFP bez terminátoru (UT) a GFP v invertované repetici (IR). Tyto tři silencery spouštěly PTGS, čtvrtý silencer byla IR cílící na CaMV 35S promotor a spouštějící TGS. To nám umožnilo studovat RNAi od její iniciace, přes plné umlčení až po obnovení exprese při vysazení induktoru - vše relativně snadno analyzovatelné díky vysoce homogennímu...
|
|
|
Úloha variabilních řetězců na rozhraní podjednotek ve formování ATP-vazebné kapsy a funkci P2X4 receptoru
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Novotný, Jiří (oponent) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
5 ABSTRAKT Krystalizace P2X4 receptoru (P2X4R) ze zebřičky ("zebra fish", zfP2X4) v uzavřeném a otevřeném stavu odhalila změny v konformacích ektodomény včetně změn v oblasti styčných ploch mezi levou ("left flipper"; LF) a hřbetní ("dorsal fin"; DF) ploutví. Roli těchto struktur ve formování ATP vazebné kapsy a funkci receptoru jsme zkoumali pomocí alaninové skenovací mutageneze úseků LF (D280-N293) a DF (R203-L214) potkaního P2X4R, a s využitím ATP a analogických agonistů 2-(methylthio)adenosin 5'- trifosfátu, adenosin 5'-(γ-thio)trifosfátu, 2'(3'-O-(4-benzoylbenzoyl)adenosin 5'- trifosfátu a α,β-methylenadenosin 5'-trifosfátu. Sníženou citlivost anebo účinnost ATP mělo 15 z 26 vytvořených mutací. Mutace R203A, N204A a N293A byly v podstatě nefunkční, ale jejich funkci bylo možné obnovit ivermektinem, alosterickým modulátorem P2X4R. Mutace I205A, T210A, L214A, P290A, G291A a Y292A měly změněnou odpověď na ATP a na analogické agonisty. Naproti tomu mutace L206A, N208A, D280A, T281A, R282A a H286A nevykazovaly ve srovnání s divokým typem receptoru žádnou změnu v odpovědích na ortosterické agonisty. Tyto pokusy, společně s homologním modelováním ukázaly, že aminokyseliny z první skupiny nacházející se v horní části obou řetězců LF a DF, se podílejí na přesné organizaci ATP-vazebné kapsy a iniciaci převodu...
|
host ::
RSS.